客戶文章|1區，m5C RNA甲基化測序&5mC DNA甲基化測序助力番茄果實成熟機制研究

日期：2022年11月16日來源：

成熟是果實美味的最后一個不可逆的發育階段，能促進果實傳播，但是果實成熟的調控機制還未完全闡明。2022年8月25日，云序客戶北京農林科學院左進華課題組在the plant journal雜志上發表了文章“DNA and coding/non-coding RNA methylation analysis provide insights into tomato fruit ripening”。該研究通過對不同成熟階段的番茄果實甲基化程度進行比較，在轉錄和表觀遺傳水平上探討了肉質果實成熟過程中的調控關系，并構建了協調調控網絡模型。云序生物有幸參與了此項研究中的m5C merip seq、5mC medip seq、全轉錄組測序等高通量技術服務。

發表期刊：the plant journal
影響因子：7.091
發表時間：2022年8月25日
研究方法：m5C merip seq、5mC medip seq、全轉錄組測序
文章鏈接：DNA and coding/non-coding RNA methylation analysis provide insights into tomato fruit ripening

云序生物提供的服務：

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技術路線

研究內容

1.Alisa Craig（AC）番茄果實成熟過程中的多組學特征分析
全轉錄組測序結果發現番茄果實中有2851個基因存在差異表達。其中1148個基因表達上調，1703個基因表達下調。由于DNA甲基化狀態是番茄果實成熟調控的一個指標，隨后，作者利用5mC medip seq檢測了在發育過程中與番茄成熟基因相關的DNA（5mC）甲基化的變化，KEGG通路分析顯示，與苯丙氨酸代謝、脂肪酸代謝、苯丙素生物合成和植物激素信號轉導相關的基因被富集（圖1a），GO富集分析發現，所有的差異甲基化基因都在脂質代謝過程中富集，并且在啟動子、上游區域、內含子、外顯子和基因間區域中都能檢測到內部5mC甲基化峰，啟動子上的5mC峰最多。(圖1b）。結果表明，5mC在番茄基因組的所有染色體上廣泛分布，低甲基化區域多于高甲基化區域，果實成熟過程中DNA（5mC）甲基化呈整體減少趨勢（圖1c）。此外，差異甲基化區域（DMRs）和差異表達基因（DEGs）數據的整合揭示了參與植物激素生物合成和信號轉導的基因，如生長素響應蛋白IAA17（IAA17）、aba響應元件結合因子（AREB1）、生長素響應蛋白SAUR50（SAUR50）和gibbberrellin2-雙加氧酶3。
為了確定m5C峰在番茄中的分布，作者比較了AC-MG和ACBr + 6期的DMRs。m5C merip seq發現番茄中存在m5C峰富集的序列基序，如UGUAC和UUCU，此外，還發現了另外兩個基序GUGGRG和UAUAUG（圖2a-d）。

圖1.綠熟期（MG）和紅熟6期（Br + 6）AC番茄DNA上的5mC甲基化檢測

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圖2.Br + 6與MG的AC中m5C甲基化譜概述

2、番茄果實成熟過程中的多組學特征分析
對綠熟期與黃熟期Nr果實的全轉錄組測序分析發現，共有2247個差異表達基因（DEGs），其中858個表達上調，1389個表達下調（圖3a)。并且在Nr果實成熟過程中鑒定出了31個環狀RNA和32個lncRNA的差異表達情況。此外，作者還進行了DNA（5mC）甲基化分析，以深入探究了Nr突變體果實在不同階段的（5mC）水平。在基因組水平上，DMRs在每個染色體上的分布并不均勻；1號染色體甲基化區域最多，6號染色體甲基化區域最少（圖3b)，在12條染色體上，共鑒定出1694個上調的DMRs和4190個下調的DMRs（圖3c）。研究結果表明，RNA甲基化（m5C）能功能調控基因的表達，但是m5C與mRNA豐度之間的相關性仍有待進一步探索（圖3d)。此后，為了驗證m5C豐度的差異，作者選擇了參與果實成熟的基因，并驗證了WRKY TFs和MADS-box蛋白EJ2中m5C的豐度變化（圖3e-f）。

圖3.Nr基因在DNA（5mC）甲基化和RNA（m5C）甲基化水平上的影響及DE編碼和非編碼基因的表達

3、AC和Nr果實綠熟期的多組學概況分析
對AC和Nr果實成熟綠色期的DEG進行比較分析，共發現1981個差異表達基因，其中977個表達上調，1004個表達下調（圖4a-b)。在AC和Nr突變體果實之間共鑒定出100個DMRs，其中許多都參與了果實的成熟過程，并且發現5mC在基因間和上游DNA區域周圍高度富集（圖4c)。此外，KEGG分析表明，甲基化基因富集于萜類主干生物合成、淀粉和蔗糖代謝以及戊糖和葡萄糖醛酸鹽的相互轉化的通路上（圖4d），隨后，作者研究了Nr果實成熟過程中與基因表達相關的乙烯釋放過程中DNA甲基化（5mC）的變化，發現EBF1和ERF6被高甲基化，同時Nr-G和AC-MG的表達表達下調（圖4e）。一些DMRs和DEGs，如a-Man、PG、CESA2、PEI、PE和XTH23也被發現參與了果實的質地調控(圖4f）。

圖4.轉錄組的概述，以及DNA甲基化（5mC）和RNA甲基化（m5C）水平

4、AC與Nr果實成熟期的多組學譜分析
作者比較了Nr-O和AC-Br + 6果實之間的DEGs，發現了2261個DEGs，其中1190個表達上調，1071個表達下調(圖5a）。共發現21個差異表達（DE)的 lncRNA和33個DE環狀RNA，其中有11個lncRNA和16個環狀RNA顯著上調，而10個lncRNA和17個環狀RNA被下調(圖5a）。DMRs的GO和KEGG通路分析顯示，Nr-O和Nr-G中存在許多與油菜素內酯生物合成、倍半萜生物合成、三萜生物合成、二萜生物合成和類胡蘿卜素生物合成相關的基因。根據MeDIP-seq的結果，這些序列的長度在1000~10000bp之間（圖5b），此外，作者還發現了許多編碼轉錄因子的基因，如bHLH18/74/90/123、MYB13/20/21/36/41S3和WRKY49/72/ 77（圖5c）。

圖5 比較Nr-O和AC-Br + 6果實中DNA、mRNA及非編碼RNA的甲基化情況

5.AC和Nr突變體果實成熟過程的多組學比較分析
為了確定AC果實和Nr突變體果實成熟過程之間的差異，作者比較了AC-MG與AC- Br + 6和Nr-MG與Nr-O之間的DEGs，共發現63個DEGs，其中14個表達上調，49個表達下調（圖6a)。相比之下，僅Nr突變體的果實中就有86個與成熟相關的基因差異表達，其中33個基因表達上調，53個基因表達下調（圖6b）。隨后，通過比較AC和Nr果實中與細胞壁代謝相關的基因，作者發現這些基因在Nr中的表達倍數變化大于AC果實。并且乙烯合成和信號轉導相關基因的表達量Nr果實大于AC果實。為了進一步探究果實間的成熟過程差異，作者還分析了Nr-O、Nr-G、ACBr + 6和AC-MG組的環狀RNA、lncRNAs及其相應的靶基因。在AC和Nr果實中發現11個lncRNA和10個環狀RNA為差異表達，其中3個lncRNA上調，8個lncRNA下調，6個環狀RNA上調，4個環狀RNA下調，并且在Nr中特異性鑒定出19個lncRNA和22個環狀RNA(圖6f-g）。通過DMRs和DEGs聯合分析結果的維恩圖，顯示了AC-MG和AC-Br + 6與Nr-MG和Nr-O對照組中常見和特異性的甲基化基因，并發現在Nr突變體中表達的特定基因中，96個DEGs表達降低，39個表達增加（圖6h）。

圖6.聯合分析Nr-O與Nr-G和AC-Br + 6與AC-MG之間的轉錄組、DNA甲基化（5mC）和RNA甲基化（m5C）水平。

總結

該篇文章聯合m5C merip seq和5mC medip seq技術，在轉錄和表觀遺傳水平上探討了肉質果實成熟過程中的調控關系，并構建了協調調控網絡模型（圖7），發現AC和Nr中的DMRs和DEGs協同作用與乙烯釋放、類胡蘿卜素積累和細胞壁代謝有關，從而調節果實成熟。首次揭示了mRNA和ncRNA m5C的表達譜，為今后研究果實的成熟和衰老提供了參考數據。

圖7.果實成熟過程中乙烯反應和類胡蘿卜素積累、細胞壁分裂和芳香化合物相關途徑的調控模型。

云序生物m5C甲基化研究五大模塊

01 m5C RNA甲基化測序

m5C RNA甲基化測序（m5C-seq）

對m5C RNA甲基化，目前最流行的檢測手段為m5C-Seq技術，適用于m5C RNA甲基化譜研究，快速篩選m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m5C測序：

m5C 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
m5C LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
m5C Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
m5C mRNA測序

02 檢測整體m5C RNA甲基化水平

LC-MS/MS檢測整體RNA甲基化水平

精準高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。

03 m5C RNA甲基化上游酶的篩選

m5C RNA甲基化相關酶PCR芯片

尋找上游直接調控m5C RNA甲基化的甲基轉移酶。

04 m5C RNA甲基化靶基因驗證

meRIP-qPCR

云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

05 機制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR

篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

5.3 雙熒光素酶實驗

驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。

5.4 ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

云序生物DNA甲基化介紹

DNA甲基化：DNA甲基化能控制基因表達，因而在動植物的生長發育過程中發揮著關鍵的調控作用，并且與包括癌癥在內的多種人類疾病密切相關，是表觀遺傳學研究的熱點。
01 MeDIP甲基化測序
將甲基化DNA免疫共沉淀技術（MeDIP）和高通量測序相結合，能夠幫助客戶快速地獲取全基因組范圍內的DNA甲基化圖譜，并比較不同樣品中的甲基化分布差異。配合強大的生信分析實力，我們提供的不僅是海量的測序數據，而且是根據您的研究目的，有針對性地挖掘提煉出取之即可用的結果及出版級圖片。
MeDIP優勢：
1.1 相比于WGBS全基因組檢測，性價比更高！
1.2實現對甲基化（5mC）和羥甲基化（5hmC）的區分。

02 ctDNA EM-seq甲基化測序
針對體液樣品中的 ctDNA 進行優化，云序生物為您帶來一種基于酶學方法的 DNA甲基化測序技術 EM-seq（Enzymatic Methyl-seq）。該方法結合使用多種酶，在保證 5mC 和 5hmC 在 Illumina 測序中仍被識別為 C 的前提條件下，將未發生修飾的胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U），并在后續的擴增和測序過程中被識別為胸腺嘧啶（T）。EM-seq 有效彌補了全基因組重亞硫酸鹽法測序（WGBS）需要極端反應條件的缺陷，可以廣泛應用于包含 ctDNA 在內的微量脆弱 DNA 樣品。運用 EM-seq 技術，僅需低至 10 ng 的 DNA 樣品便可進行單堿基精度的全基因組 5mC 修飾測序。

EM-seq 的優勢相比于傳統的WGBS 擁有多種優勢：
2.1 DNA 測序文庫質量高、所需 DNA 起始量小
相比于WGBS，EM-seq 對 DNA 的損傷小，因此可以用更少 DNA 樣品、更少的 PCR 輪數擴增出高質量的測序文庫。云序生物提供的 EM-seq 服務，所需的 DNA 起始量可低至10ng。
2.2 DNA 文庫的插入片段更長、更完整
相比于WGBS，EM-seq 處理后的 DNA 片段更完整，長度更長，避免產生測序缺口。
2.3 出色的 GC 覆蓋均一性
無論 GC 程度高低，EM-seq 的覆蓋度都有均勻且優良的表現；相比之下，WGBS 測序文庫高估了 AT 區，卻低估了 GC 區，造成“GC 覆蓋度偏誤”。
2.4 均一的雙核苷酸分布
由于“GC 覆蓋度偏誤”的存在，在連續雙核苷酸的檢出效率方面，WGBS 對于不同的雙核苷酸存在較嚴重的偏誤，而 EM-seq 則能展示出均一的覆蓋情況。
2.5 更強的匹配率和更低的重復率
相比于 WGBS，EM-seq 測序結果與參考基因組的匹配率更高，同時重復率更低。
2.6 用更少的測序檢出更多的 CpG 島
同等測序覆蓋深度的情形下，EM-seq 所發現的 CpG 數目要遠多于 WGBS，在這其中有很大比例的 CpG 位點是僅僅只能能用 EM-seq 法才能檢測到的。

云序生物服務優勢

優勢一：云序累計支持客戶發表 87 +篇RNA修飾及DNA修飾SCI論文，合計影響因子 810 +
優勢二：累計完成數千例 RNA及DNA甲基化測序樣本，全面覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：全面檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：提供m5C一站式服務：m5C整體水平檢測、m5C-seq、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。
優勢五：超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：全面提供多種 RNA 修飾測序服務，包含m6A、m6Am、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。
優勢七：全面提供多種DNA修飾測序服務，包括5mC、5hmC、6mA等甲基化測序。

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