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表觀轉錄組+翻譯組實驗揭示 tRNA 的 m7G 修飾如何影響食管鱗癌中的蛋白翻譯效率

日期：2022年12月01日來源：

m7G 修飾最常見于成熟 mRNA 的 5' 帽子結構當中，然而除此之外，在 mRNA 內部以及多種非編碼 RNA 當中也有發現 m7G 修飾的存在，這其中就包括 tRNA。然而，tRNA 的 m7G 修飾對于與 mRNA 翻譯效率的作用仍然有待闡明。在 2022 年 3 月發表于 Nature Communications 上的一篇論文當中，來自中山大學附屬第一醫院等機構的研究人員在食管鱗癌細胞中通過 m7G 修飾測序發現了帶有 m7G 修飾的 tRNA，并通過 Ribo-seq 等翻譯組學實驗找出了這些 m7G 修飾的 tRNA 與 RPTOR/ULK1/自噬通路蛋白翻譯效率之間的關系。

論文標題：N⁷-methylguanosine tRNA modification promotes esophageal squamous cell carcinoma tumorigenesis via the RPTOR/ULK1/autophagy axis
發表期刊：Nature Communications（IF= 17.694）
研究方法：LC-MS 核酸修飾水平檢測、tRNA m7G 修飾測序、核糖體印記測序（Ribo-seq）、mRNA qPCR

研究思路圖

1、ESCC 當中的 METTL1/WDR4 表達升高，且與不良預后相關
METTL1/WDR4 復合體是人類細胞當中催化 tRNA 發生 m7G 修飾的甲基化轉移酶（即“Writer”）。作者在 TCGA 數據庫中發現多種癌癥當中都存在 METTL1 和 WDR4 的 mRNA 水平升高的現象，其中就包括食管鱗癌（后簡稱 ESCC, 即 esophageal squamous cell carcinoma）。在作者收集的 ESCC 臨床患者的癌組織中（n=6），mRNA qPCR 和蛋白質 Western blot實驗也發現 METTL1/WDR4 在 mRNA 和蛋白質水平均相比于對照組發生上調。針對 METTL1 或 WDR4 蛋白的組織免疫染色（IHC）結果更顯示，METTL1 或 WDR4 蛋白水平越高，病人的預后就越差。

2、敲降 METTL1 或 WDR4 可抑制 ESCC 腫瘤發展
作者在 ESCC 細胞系當中敲降 METTL1 基因，結果發現細胞增殖減緩、聚落形成能力減弱。流式細胞儀分選結果也顯示，METTL1 敲降組的凋亡細胞比例增加。作者還在小鼠當中進行了人源 ESCC 細胞移植的體內實驗，發現注射 METTL1 敲降 ESCC 細胞的小鼠相比于注射普通 ESCC 細胞的對照組小鼠擁有更緩慢的腫瘤生長速度、更小的腫瘤體積和重量。細胞增殖標記蛋白 Ki67 的免疫組化染色結果也顯示，METTL1 敲降細胞在小鼠體內降低了腫瘤細胞的增殖能力。
作者隨后也針對另一個 m7G Writer 基因 WDR4 進行了敲降，收到了與 METTL1 敲降類似的體外和體內實驗結果，說明敲降 WDR4 也可抑制 ESCC 的腫瘤發展。

3、METTL1 在 ESCC 中促進 m7G tRNA 修飾，進而促進 mRNA 翻譯
作者對 ESCC 細胞當中提取的 tRNA 進行了 m7G 修飾測序，發現了 19 個發生 m7G 修飾的 tRNA。這些 tRNA 上的 m7G 位點顯示出 ABGWY 的 motif 序列特征。相比于對照組，METTL1 敲降組當中的 tRNA m7G 修飾水平顯著下降。作者更換 LC-MS 實驗方法（n=3）再次檢驗 m7G 修飾的整體水平，發現 METTL1 敲降組確實低于對照組。tRNA 測序的結果還顯示，METTL1 敲降會大大降低含有 m7G 修飾的 tRNA 的水平，但對其它種類的 tRNA 卻幾乎沒有影響。針對 tRNA 進行的 Northern blot 實驗結果也發現 METTL1 敲降/過表達會降低/升高受 m7G 修飾的 tRNA 水平（其中包括 ValAAC 和 LysCTT 這兩種 tRNA），這一現象進一步證明 METTL1 可通過發揮 m7G 修飾酶的功能來提升受 m7G 修飾的 tRNA 的水平。

作者隨后也針對另一個 m7G Writer 基因 WDR4 進行了敲降/過表達實驗，收到了與 METTL1 敲降/過表達類似的 m7G 修飾 tRNA 調控效果，說明 METTL1/WDR4 復合體可通過發揮 m7G 修飾酶的功能來提升受 m7G 修飾的 tRNA 的水平。

作者對 METTL1 敲降細胞以及對照細胞進行了多聚核糖體分析（Polysome profiling assay），發現 METTL1 敲降可以抑制 mRNA 翻譯活動（多聚核糖體下調）。蛋白質合成抑制劑嘌呤霉素的攝入實驗（Puromycin intake assay）亦顯示 METTL1 敲降可抑制 mRNA 翻譯活動。作者由此認為，METTL1 介導的 m7G tRNA 修飾對于 tRNA 的表達以及 mRNA 的翻譯發揮了不可或缺的作用。

4、METTL1 通過 m7G 修飾的 tRNA 所對應的密碼子起到 mRNA 翻譯限速的作用
為了深入研究異常 tRNA m7G 修飾導致的蛋白翻譯失常，作者對 METTL1 敲降細胞以及對照細胞進行了多聚核糖體測序（Polyribosome-seq），并計算了測序結果當中 mRNA 上的 m7G 修飾的 tRNA 所對應的密碼子的數量。結果顯示，mRNA 上 m7G 修飾的 tRNA 所對應的密碼子越多，翻譯效率（Translation efficiencies, TE）也就越低。針對這些翻譯效率降低的基因所做的 GO 分析和 KEGG 通路分析結果顯示，這些基因大多與細胞自噬以及 mTOR 信號通路相關。作者進一步對 METTL1 敲降細胞以及對照細胞進行了核糖體印記測序（Ribo-seq），發現 METTL1 敲降后翻譯效率降低的 mRNA 擁有更多數量的 m7G 修飾 tRNA 所對應的密碼子，并且 METTL1 敲降會使得翻譯活動停頓在 m7G 修飾 tRNA 所對應的密碼子位置上。Ribo-seq 所發現的這些結果證明，METTL1 介導的 tRNA m7G 修飾對于 mRNA 的翻譯是不可或缺的。針對 Ribo-seq 結果當中組間差異翻譯的 mRNA 進行的 GSEA 分析結果也顯示，METTL1 對于細胞自噬負調控相關基因以及 mTOR 信號通路相關基因呈正相關關系。

針對細胞自噬負調控基因以及 mTOR 信號通路相關基因的 mRNA qPCR 以及 Western blot 結果顯示，METTL1 敲降主要降低這些基因所編碼的蛋白質的表達水平，但是在 mRNA 水平卻沒有明顯的影響。多聚核糖體-qPCR 實驗進一步證明了 RPTOR（mTOR 復合體1相關調控蛋白， Regulatory Associated Protein of mTOR Complex 1 ）的翻譯效率受到 METTL1 敲降的負調控。早前的研究已知 mTOR 信號通路通過 ULK1 蛋白上的 ser785 位點磷酸化來負調控細胞自噬，于是作者通過 Western blot 檢測了 METTL1 敲降細胞當中普通 ULK1 蛋白、磷酸化 ULK1 蛋白，以及細胞自噬標記蛋白 LC3-II、LC3-I 的蛋白水平，發現普通 ULK1 蛋白增加，而磷酸化 ULK1 蛋白減少，并且 LC3-II/LC3-I 比值上升，說明 METTL1 敲降可增加細胞自噬?？偠灾?，METTL1 通過 tRNA 的 m7G 修飾促進 mTOR 信號通路基因的翻譯，進而對細胞自噬起到了負調控作用。

5、METTL1 通過 RPTOR/細胞自噬軸來影響 ESCC 腫瘤發展
作者在 METTL1 敲降的 ESCC 細胞中過表達 RPTOR，發現細胞增殖和聚落形成能力得到恢復，并且可以增加 ULK1 細胞的磷酸化水平，降低 LC3-II/LC3-I 比值，消除細胞自噬流（Autophagic flux）。因此，作者認為 RPTOR 確實是 METTL1 調控的下游靶標。

作者隨后在 METTL1 敲降的 ESCC 細胞中敲降 ULK1，以確定 METTL1 和 RPTOR 是否通過調節 ULK1 介導的自噬來促進 ESCC 的進展。結果顯示，METTL1 敲降細胞當中的 ULK1 敲降可以挽救 ESCC 細胞的生長，并且可以消除細胞自噬流。除了 ULK1 以外，作者還選用了另外兩個細胞自噬負調控基因 VPS34 和 BECN1 進行了敲降實驗，得到了與 ULK1 敲降類似的結果。以上現象證明，METTL1 通過 RPTOR/細胞自噬軸來影響 ESCC 發展。

6、體內實驗證明 METTL1 的條件敲除可抑制 ESCC 腫瘤發生

作者在小鼠當中進行了上皮組織特異性 METTL1 條件敲除（Conditional knockout, cKO），并對 cKO 組小鼠和對照組小鼠都施用 DNA 烷化劑 DEN 和激酶抑制劑 sorafenib 以誘導 ESCC 的腫瘤發生。結果顯示，對照組小鼠的食管出現了明顯的 ESCC 腫瘤發生，但 cKO 組的 ESCC 發生數以及受損區域都要比對照組小得多。組織免疫染色結果也顯示，cKO 組小鼠的 METTL1 以及細胞增殖標記蛋白Ki67 染色都更深。針對 RPTOR 的 mRNA qPCR、蛋白 Western blot 以及免疫組化染色實驗結果也證明，METTL1 的 cKO 處理降低了 RPTOR 蛋白水平，但對 mRNA 水平幾乎沒有影響。Northern blot 實驗結果還發現， METTL1 的 cKO 處理降低了 m7G 修飾水平。免疫熒光染色實驗還發現，cKO 組當中的 LC3 蛋白水平明顯高于對照組，說明 METTL1 的 cKO 處理增強了細胞自噬現象?？偠灾?，METTL1 介導的 tRNA m7G 修飾在體內可促進 ESCC 腫瘤發生。

7、METTL1/WDR4 介導的 tRNA m7G 修飾促進 ESCC 發展
作者還進行了功能增益研究（Gain-of-function studies），在 ESCC 細胞系中分別進行了野生型 METTL1 過表達以及無催化活性的突變型 METTL1 過表達，結果發現只有野生型 METTL1 過表達才能增強 ESCC 細胞的生長和聚落形成能力，提升 RPTOR 蛋白表達水平，并降低細胞凋亡和自噬現象。

作者隨后也對 WDR4 基因進行了類似的野生型/突變型功能增益實驗，得到了與 METTL1 類似的結果?？偠灾?，METTL1/WDR4 介導的 tRNA m7G 修飾可以促進 ESCC 的發展。

8、體內實驗證明 METTL1 促進 ESCC 腫瘤發生
作者在小鼠體內進行了上皮組織特異性 METTL1 條件敲入（Conditional knockin，cKI），并對 cKI 組小鼠和對照組小鼠都施用 DNA 烷化劑 DEN 和激酶抑制劑 sorafenib 以誘導 ESCC 的腫瘤發生。結果顯示，cKI 組小鼠的食管形成了大型的腫瘤，但在對照組當中 ESCC 發生數以及受損區域都要小得多。免疫組化染色結果也顯示，cKI 組小鼠體內含有更高的 METTL1 和 Ki67 蛋白表達水平。Northern blot 實驗結果也顯示 cKI 組當中的 tRNA m7G 修飾水平升高。mRNA qPCR 和 Western blot 結果則顯示，在 cKI 組當中，RPTOR 蛋白水平上升，但 RPTOR 的 mRNA 水平幾乎不變。綜上所述，METTL1 催化的 tRNA m7G 修飾促進了 ESCC 的腫瘤發生。

總結

綜合本文當中的多種實驗結果，作者總結出這樣的一套分子機制：METTL1/WDR4 在 ESCC 中高表達，以維持 tRNA 上的 m7G 修飾。若敲降 METTL1/WDR4，m7G 修飾的 tRNA 便會下調，致使需要使用到 m7G 修飾的 tRNA 進行翻譯的 mRNA 的蛋白翻譯效率下降——這些蛋白翻譯下降的基因，許多富集在細胞自噬負調控通路，最終使得細胞自噬活動增強，減弱了 ESCC。而在 ESCC 癌組織當中，高表達的 METTL1/WDR4 則通過相反的調控方式，降低了細胞自噬活動，最終導致了腫瘤發生。

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