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用戶文章 IF=9.685|m5C bis-seq助力NSUN2的致癌活性機制研究

日期：2023年01月04日來源：

5-甲基胞嘧啶（m5C）RNA甲基轉移酶NSUN2參與了細胞增殖和轉移形成的調控，并在多種癌癥中表達上調。然而，NSUN2在胃癌（GC）中的生物學意義以及NSUN2本身的修飾尚未得到充分的研究。2021年8月9日，云序客戶溫州醫科大學第二附屬醫院盧明東團隊在Cell Death Dis（IF=9.685）上發表文章“NSUN2 modifified by SUMO-2/3 promotes gastric cancer progression and regulates mRNA m5C methylation”。該研究發現，NSUN2在胃癌中表達上調，是胃癌預后不良的預測因子。揭示了NSUN2在GC進展中發揮作用的新機制，為胃癌患者提供新的治療選擇。云序生物有幸參與了此項研究中的m5C bis-seq高通量測序技術服務。

發表期刊：Cell Death Dis
影響因子：9.685
發表時間：2021年8月9日
研究方法：m5C bis-seq、CO-IP、qRT-PCR
文章鏈接：NSUN2 modified by SUMO-2/3 promotes gastric cancer progression and regulates mRNA m5C methylation

技術路線

研究內容

1.GC中m5C調控因子的表達景觀及臨床相關性
為了評估m5C調控因子在GC中的表達譜，作者從TCGA胃腺癌（STAD）項目中提取了與m5C相關的基因測序數據。在熱圖中展示了基因的整體表達水平（圖1A）。與對照組相比，m5C調節因子在GC樣品中普遍高表達，并且通過m5C調節網絡描述了它們的相互作用和對胃癌患者總生存率的影響（圖1B）。結果表明，NSUN2與其他m5C調控因子密切相關，且m5C調控因子的整體表達水平與患者的總生存率顯著相關。

2.NSUN2在胃癌中高表達，并與不良預后相關
根據TCGA數據，作者發現NSUN2在多種癌癥中均過表達（圖1C）。為了進一步研究NSUN2的表達模式和胃癌患者的臨床意義，作者用GC組織芯片對NSUN2進行了IHC染色，IHC結果顯示，NSUN2主要在癌細胞的細胞核中表達，部分在細胞質中表達（圖1D）。NSUN2在腫瘤組織中的表達高于在鄰近正常組織中的腫瘤組織（圖1E-F）。此外，Kaplan-Meier生存分析結果也表明，NSUN2高表達的胃癌患者總生存期（OS）低于NSUN2低表達的胃癌患者（圖1G）。

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圖1.RNAm5C調控因子在胃癌（GC）和NSUN2中的表達景觀及臨床相關性

3.NSUN2可促進胃癌細胞的增殖和轉移
為了研究NSUN2在GC細胞中的致瘤作用，作者用siRNA敲除BGC-823和SGC- 7901細胞中的NSUN2。通過免疫印跡法檢測，發現NSUN2的表達顯著降低（圖2A）。之后，為了確定NSUN2對GC細胞增殖的調控作用，作者進行了CCK-8和5-乙基-2’-脫氧尿苷（EdU）檢測，發現NSUN2的下調導致BGC-823和SGC-7901細胞的增殖率下降（圖2B、D）。與對照組相比，NSUN2過表達導致細胞增殖率顯著增加（圖2E-I）。采用集落形成試驗來確定NUSN2對GC細胞增殖的長期影響。結果發現，兩周后，NSUN2敲除組形成的菌落較少，而與對照組相比，NSUN2過表達組形成的菌落數量有所增加（圖2C、H）。綜上所述，NSUN2可促進GC細胞的增殖。

為了進一步探索NSUN2在GC進展中的作用，作者在BGC-823和SGC-7901細胞中進行了NSUN2敲低和過表達的遷移和侵襲實驗。結果顯示，與si-NC組相比，轉染了si-NSUN2的GC細胞的遷移和入侵細胞數量顯著減少（圖3A-B），與對照組相比，過表達NSUN2的GC細胞的遷移和侵襲能力有所增加（圖3C-D）。

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圖2 NSUN2促進人胃癌（GC）細胞的生長

圖3 NSUN2促進胃癌（GC）細胞的遷移和侵襲

4.SUMO-2/3調節NSUN2的蛋白穩定性和亞細胞定位
為了探討NSUN2促進GC的分子機制，作者通過進行免疫共沉淀（CO-IP）和質譜分析，研究了蛋白與NSUN2相互作用。CO-IP結果顯示，SUMO-2/3被NSUN2-HA拉下，表現出直接的相互作用（圖4A），并且還發現了兩個SUMO相互作用基序（SIMs）和五個SUMOylation共識位點（圖4B）。之后，通過兩個突變質粒的構建，作者將NSUN2- HA、Δ236-240aa和Δ497-711aa轉染到BGC-823細胞中，并進行CO-IP檢測。發現轉染NSUN2-Δ236-240aa后，NSUN2與SUMO-2/3之間的相互作用幾乎消失，而轉染NSUN2-Δ497-711aa后的相互作用略有下降（圖4C）。此外，為了探討NSUN2的SUMO化修飾是否影響蛋白水平。作者將抗SUMO-2/3的si-rna轉染到BGC-823細胞中，并通過蛋白印跡法檢測NSUN2蛋白水平，結果表明在SUMO-2/3基因敲除后，NSUN2的總蛋白水平幾乎沒有下降（圖4D）。為了研究SUMO化修飾是否能改變NSUN2的亞細胞定位，作者轉染了NSUN2-HA質粒，發現過表達NSUN2導致NSUN2在細胞質和細胞核中的表達顯著增加(圖4E）。將NSUN2-HA和SUMO-2/3si-RNAs共轉染到細胞中，并分離出細胞質和核蛋白。結果顯示在SUMO-2/3基因敲低后，NSUN2蛋白在細胞質中的水平略有下降，而在細胞核中的水平顯著下降(圖4F）。對NSUN2敲除的MGC-803（圖4G）和BGC-823進行免疫熒光（IF）檢測。檢測NSUN2-HA和si-SUMO-3-2轉染后NSUN2的亞細胞分布，結果表明SUMO-2/3基因敲低抑制了NSUN2向細胞核的易位。

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圖4 SUMO-2/3與NSUN2相互作用，保持其穩定性，促進其核易位

5.NSUN2通過m5C依賴和獨立機制促進胃進展
為了確定NSUN2的致癌功能是否依賴于其m5C甲基轉移酶活性，作者通過引入釋放（半胱氨酸271）和催化（半胱氨酸321）位點的點突變，生成了NSUN2的兩個酶死亡突變體（圖5A）。通過過表達NSUN2野生型和突變質粒BGC-823NSUN2-prhinty細胞系，發現NSUN2的野生型和酶死突變體能夠部分拯救GC細胞的增殖和轉移的能力，和野生型NSUN2呈現更重要的功能(圖5B-C），這些結果表明，NSUN2通過m5C依賴和獨立的機制促進胃進展。為了探索NSUN2依賴于m5C的功能，作者用m5C Bis-Seq獲得了GC細胞中NSUN2敲除后轉錄組范圍內的m5C修飾。對WT在NSUN2敲除細胞中分別鑒定出3260和712個m5C峰和135和70個獨特基因（圖5D），證實了真核mRNA中的m5C修飾主要是由NSUN2催化的。并且根據RNA轉錄本中m5C峰的定位，將其分為5’UTR區、StartC、編碼序列（CDS）、StopC和3’UTR（圖5E），其中m5C位點位于CG富集區中（圖5F）。KEGG分析顯示，NSUN2介導的m5C修飾基因在多種癌癥相關信號通路中顯著富集，如Rap1信號通路、鉑類耐藥性和細胞周期過程的調控等（圖5G）。這些數據表明，NSUN2介導的GC轉錄本中的m5C修飾與RNA代謝和癌癥發展密切相關。

此外，作者還研究了m5C峰的變化是否會影響mRNA的表達水平。通過篩選了NSUN2-KO BGC- 823細胞中下調基因下降的m5C峰，鑒定了NSUN2的6個候選靶點，包括CCDC85B、SHOC2、PCYT1A、MT-ND4、SREK1和PIK3R1（圖6A）。共表達熱圖顯示，NSUN2的表達與除CCDC85B外的所有這些基因均密切相關（圖6B）。之后qRT-PCR證實了NSUN2基因敲除后，PIK3R1和PCYT1A的表達水平顯著降低，因此，作者推測PIK3R1和PCYT1A可能是NSUN2修飾的m5C的靶基因。綜上，NSUN2介導的m5C修飾影響了GC的形成。

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圖5 NSUN2的致癌性部分依賴于m5C的修飾

圖6 NSUN2潛在的m5C修飾候選基因可直接靶向基因

總結

本研究通過m5C bis-seq分析，證實了NSUN2在胃癌中表達上調并與不良預后相關，并通過測定了m5C在GC mRNA中的分布，發現m5C修飾的基因主要參與了多種癌癥相關的信號通路，SUMO化修飾-NSUN2-m5C軸可能是胃癌和泛癌治療的一個新的診斷和治療靶點（圖7 ）。

圖7 SUMO-2/3-NSUN2-m5C修飾在胃癌中的功能景觀模型

云序生物m5C甲基化研究五大模塊

01 m5CRNA甲基化測序
m5C RNA甲基化測序（m5C-seq）
對m5C RNA甲基化，目前最流行的檢測手段為m5C-Seq技術，適用于m5C RNA甲基化譜研究，快速篩選m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m5C測序：

m5C 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
m5C LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
m5C Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
m5C mRNA測序

02 檢測整體m5CRNA甲基化水平

LC-MS/MS檢測整體RNA甲基化水平
精準高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
03 m5CRNA甲基化上游酶的篩選
m5C RNA甲基化相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m5C RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m5CRNA甲基化靶基因驗證
meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05 機制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR

篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

5.3 雙熒光素酶實驗

驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。

5.4 ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

云序生物服務優勢

優勢一：云序累計支持客戶發表 100 + 篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子 960 +
優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：可檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

優勢四：提供m5C一站式服務：m5C整體水平檢測、m5C-seq、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。