技術簡介
m5C RNA是近年來發現的一類在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。利用高通量測序手段驗證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C存在，但是在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒有系統性報道。云序生物率先開展m5C RNA甲基化測序服務，采用經典重亞硫 酸鹽處理的方式進行測序。在全轉錄范圍內及tRNA水平查看基因m5C甲基化修飾水平。
云序生物（m5C）RNA甲基化測序流程
云序生物RNA甲基化測序產品
一站式服務：
客戶只需提供組織、細胞、體液樣品或RNA，云序生物為您完成m5C RNA-Seq全套實驗服務。
嚴格的質控：
云序生物對m5C RNA-Seq實驗每一步驟均設有關鍵質控，保證客戶得到高質量質數據。
專業的生物信息學分析：
云序生物擁有專業的生物信息分析團隊，幫助客戶進行實驗數據的挖掘。
樣本要求
樣品類型：
細胞、新鮮組織或RNA樣品。其它類型樣品請詳詢。
樣品量：
a) 細胞：2×107
b) 組織：100 mg-1 g
c) RNA：30-300 μg（OD260/280：1.6-2.3；RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7）
樣品運輸與保存
樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。
樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。
數據分析（下列有※表示個性化分析）
1、識別RNA甲基化位點
通過高通量測序和生物信息分析，識別甲基化富集的基因組區域。
2、RNA甲基化位點的注釋※
富集峰識別后，得到的是一堆基因組位置信息，通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋，并根據峰中點相對于已知基因的位置，將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。
3、RNA甲基化位點在基因組中的分布※
根據注釋信息，繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。
4、RNA甲基化位點Motif分析※
RNA上甲基化的位點，可能包含某種序列motif。RNA甲基化酶可能正是通過識別這些 motif 特異性進行甲基化修飾，從而完成轉錄后調控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點后，獲取序列就能使用生物信息學的手段來搜索這些 motif，從而揭示 RNA甲基化修飾的機制。
5、差異RNA甲基化位點的識別與注釋
云序生物使用meRanCompare軟件識別兩個/組樣品間的差異甲基化位點，以FDR<0.01作為閾值，具體的以測序報告為準。 識別樣本間的差異甲基化區，發現與特定表型或疾病相關的甲基化區域。
6、差異RNA甲基化位點的GO與信號通路分析
對差異甲基化基因進行功能分類，并發現明顯富集的功能條目。
案例解析
案例1：m5C RNA甲基化調控mRNA出核新機制
原文：5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader
期刊：Cell Research 影響因子：15.60
中科院汪海林等研究團隊揭示了m5C修飾在mRNA的分布圖譜規律及其對調控mRNA出核作用新機制。研究人員建立了改進的RNA m5C單堿基分辨率高通量測序與生物信息分析技術，以此揭示mRNA m5C的分布規律，并繪制了精細的m5C修飾圖譜，發現m5C在mRNA的翻譯起始位點下游有明顯富集，并且主要分布于CG富集區域。通過分析對比人和小鼠不同組織，發現m5C在mRNA上的分布特征在哺乳動物中十分保守，而在不同組織中修飾的基因具有特異性。研究團隊同時發現，在小鼠睪丸發育過程中，動態的m5C修飾基因明顯富集于精子發育相關功能，提示m5C修飾參與生殖發育調控。
圖1. mRNA中m5C的分布規律及組織特異性表達
案例2: m5C RNA甲基化基因組分布圖譜
原文：Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain
期刊：Genome Biology 影響因子：13.21
近期刊登了解析RNA m5C在不同組織細胞的分布圖譜相關文章。研究人員選取小鼠胚胎干細胞（ESC）和腦組織（n=3）作為實驗樣本，利用m5C RNA甲基化測序技術對兩組樣本中的總RNA和胞核RNA進行檢測。結果表明，ESC中總RNA 5mC的分布頻率比腦組織的分布頻率更高。研究人員將m5C位點和不同的基因組區域（CDS, 5’-UTR, 3’-UTR等）進行了關聯分析。結果表明，總RNA中m5C位點更傾向于分布在轉錄起始位點。腦組織和ESC中，3’-UTR區m5C的分布區別很大，這暗示著3’-UTR區的RNA m5C修飾可能與細胞功能和細胞類型密切相關。
圖2. m5C的基因組位置分布
案例3：擬南芥m5C RNA甲基化譜及TRM4B酶對根的影響
原文：Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs
期刊：The Plant Cell 影響因子：8.23
與上篇不同，本研究團隊采用m5C RNA甲基化測序研究擬南芥中m5C甲基化譜，在種子，幼芽，根中發現了1000多個特異性的位點。敲低RNA m5C甲基轉移酶TRM4B，造成tRNA穩定性的降低。研究人員還證實TRM4B突變體的初級根比野生型更短，同時對氧化的應激反應更敏感。
圖3. 擬南芥種子，幼芽，根中m5C位點
云序生物